鳕鱼及其制品中裸盖鱼、油鱼和南极犬牙鱼源性成分检测 bjs 201907-凯发k8一触即发

标准信息

鳕鱼及其制品中裸盖鱼、油鱼和南极犬牙鱼源性成分检测 bjs 201907

发布时间:2019-04-11 13:48    来源:国家市场监督管理总局

1  范围

    本方法规定了鳕鱼及其制品中裸盖鱼(anoplopoma fimbria)、油鱼(lepidocybium flavobrunneum,ruvettus pretiosus)和南极犬牙鱼(dissostichus eleginoides,dissostichus mawsoni)源性成分的实时荧光pcr检测方法。

    本方法适用于鳕鱼、鳕鱼片、鳕鱼扒等生鲜或速冻鳕鱼产品(不包含鱼丸、鱼糕、鱼饼、鱼肠、鱼豆腐、鱼肝油等加工产品)中裸盖鱼、油鱼和南极犬牙鱼源性成分的定性检测。

2  原理

    使用商业化dna提取试剂盒,获得适用于实时荧光pcr检测的dna。分别使用裸盖鱼、油鱼或南极犬牙鱼特异性引物探针,通过实时荧光pcr反应,获得ct值,根据ct值判断样品是否检出裸盖鱼、油鱼或南极犬牙鱼源性成分。

3  试剂和材料

    除另有规定外,本方法中所用试剂均为分析纯,水应符合gb/t 6682的一级水要求。所有试剂均用无dna酶污染的容器分装。

3.1  引物探针序列

3.1.1  裸盖鱼源性成分nadh2基因

    裸盖鱼源成分5 ’端引物:5 ’-agggaccaccctaacattcg-3 ’

    裸盖鱼源性成分3 ’端引物:5 ’-gtgggtggtgatgctgtgct-3 ’

    裸盖鱼源性成分探针:5 ’-fam-cagctctcactgactactcgcatga-bhq1-3 ’

3.1.2  油鱼源性成分cytb基因

    油鱼源性成分5 ’端引物:5 ’-taacttcggatgactcatccg-3 ’

    油鱼源性成分3 ’端引物:5 ’-agtaaaggcctcgtccaatgt-3 ’ 

    油鱼源性成分探针:5 ’-fam-catccgaaaccttcatgcaaacggc-bhq1-3 ’

3.1.3   南极犬牙鱼源性成分ck基因

    南极犬牙鱼源性成分5 ’端引物:5 ’-ctgaatatgtaggtgcatacg-3 ’

    南极犬牙鱼源性成分3 ’端引物:5 ’-ttgctctttgtgtttcggtt-3 ’

    南极犬牙鱼源性成分探针:5 ’-fam-tccattaggtaagcgagcgggaaga-bhq1-3 ’

3.1.4  内参照基因真核生物18srrna 

    内参照5 ’端引物:5 ’-tctgccctatcaactttcgatggta-3 ’

    内参照3 ’端引物:5 ’-aatttgcgcgcctgctgccttcctt-3 ’

    内参照探针:5 ’-fam-ccgtttctcaggctccctctccggaatcgaac-bhq1-3 ’

3.2   商业化dna提取试剂盒。

3.3   商业化pcr反应预混液。

4  仪器和设备

4.1  实时荧光pcr仪。

4.2  微量紫外分光光度计。

4.3  恒温水浴锅。

4.4  高速冷冻离心机:离心力18,000 g以上。

4.5  微量移液器(0.5 μl- 10 μl,10 μl- 100 μl,20 μl- 200 μl,100 μl- 1000 μl)。

4.6  涡旋振荡器。

4.7  天平:感量0.001 g。

5  分析步骤

5.1  样品前处理

(1)样品只有单块鱼肉组成:使用灭菌剪刀适量剪取中心部位鱼肉。

(2)样品有五块以下鱼肉组成:使用灭菌剪刀适量剪取每个组成部分的中心部位鱼肉。

(3)样品有五块以上鱼肉组成:随机挑选5块鱼肉,使用灭菌剪刀适量剪取每个组成部分的中心部位鱼肉。

    将所取得的鱼肉使用灭菌去离子水洗涤,离心去除上清液,尽可能剪碎并混匀。

    注:速冻鳕鱼产品应在完全解冻后再取样。

5.2  dna提取

    按照商业化dna提取试剂盒说明书中要求的取样量称取样品,每个样品设置两个平行,按照商业化dna提取试剂盒说明书操作。

5.3  dna浓度测定

    取1 μl dna溶液,使用微量紫外分光光度计按照dsdna(双链dna)计算方式检测其浓度。

5.4  实时荧光pcr扩增

    实时荧光pcr反应体系见表1。

                          表1 实时荧光pcr反应体系

pcr预混液(2 ×

10 μl

10 μmol/l上游引物

0.4 μl

10 μmol/l下游引物

0.4 μl

10 μmol/l 探针

0.2 μl

dna

20-50 ng

灭菌去离子水

补充至总体积20 μl

    pcr反应程序:95 ℃ 15 s; 95 ℃ 5 s, 60 ℃ 34 s(读取荧光),40个循环。

5.5  实验对照

    分别设置阳性对照、阴性对照、pcr空白对照、空白提取对照各一个。

    阳性对照:含相应物种的dna。

    阴性对照:不含相应物种的dna。

    pcr空白对照:以灭菌去离子水替代dna加入实时荧光pcr反应体系。

    空白提取对照:以灭菌去离子水替代样品进行dna提取。

6  结果判断与表述

6.1  质量控制

   若以下条件的其中一条不满足要求时,结果视为无效:

   阳性对照:荧光通道出现典型的扩增曲线,相应的ct值<30.0;

   阴性对照:ct值≥35.0;

   pcr空白对照:ct值≥35.0;

  空白提取对照:ct值≥35.0;

  内参照反应:荧光通道出现典型的扩增曲线,相应的ct值<30.0;

  样品平行反应:ct值经6.2结果判定后应一致。

6.2  结果判定

    (1)如ct值<30.0,且质量控制符合要求,则判定为检出相应物种源性成分。

    (2)如ct值≥30.0,且质量控制符合要求,则判定为未检出相应物种源性成分。

6.3  结果表述

    检出 xxx 源性成分。

    未检出 xxx 源性成分。

7  防污染措施

    检测过程中放置交叉污染的措施按照gb/t 27403中的规定执行。

8 方法检出限

    裸盖鱼引物探针检出限范围为0.1 %~5 %,油鱼引物探针检出限范围为1 %~10 %,南极犬牙鱼引物探针检出限范围为1 %~2 %。

    注:因使用的设备、试剂盒不同,其检出限有所差异。


      责任编辑:小雪    

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