发布时间：2019-04-11 13:48 来源：国家市场监督管理总局
1 范围
本方法规定了鳕鱼及其制品中裸盖鱼（anoplopoma fimbria）、油鱼（lepidocybium flavobrunneum，ruvettus pretiosus）和南极犬牙鱼（dissostichus eleginoides，dissostichus mawsoni）源性成分的实时荧光pcr检测方法。
本方法适用于鳕鱼、鳕鱼片、鳕鱼扒等生鲜或速冻鳕鱼产品（不包含鱼丸、鱼糕、鱼饼、鱼肠、鱼豆腐、鱼肝油等加工产品）中裸盖鱼、油鱼和南极犬牙鱼源性成分的定性检测。
2 原理
使用商业化dna提取试剂盒，获得适用于实时荧光pcr检测的dna。分别使用裸盖鱼、油鱼或南极犬牙鱼特异性引物探针，通过实时荧光pcr反应，获得ct值，根据ct值判断样品是否检出裸盖鱼、油鱼或南极犬牙鱼源性成分。
3 试剂和材料
除另有规定外，本方法中所用试剂均为分析纯，水应符合gb/t 6682的一级水要求。所有试剂均用无dna酶污染的容器分装。
3.1 引物探针序列
3.1.1 裸盖鱼源性成分nadh2基因
裸盖鱼源成分5 ’端引物：5 ’-agggaccaccctaacattcg-3 ’
裸盖鱼源性成分3 ’端引物：5 ’-gtgggtggtgatgctgtgct-3 ’
裸盖鱼源性成分探针：5 ’-fam-cagctctcactgactactcgcatga-bhq1-3 ’
3.1.2 油鱼源性成分cytb基因
油鱼源性成分5 ’端引物：5 ’-taacttcggatgactcatccg-3 ’
油鱼源性成分3 ’端引物：5 ’-agtaaaggcctcgtccaatgt-3 ’
油鱼源性成分探针：5 ’-fam-catccgaaaccttcatgcaaacggc-bhq1-3 ’
3.1.3 南极犬牙鱼源性成分ck基因
南极犬牙鱼源性成分5 ’端引物：5 ’-ctgaatatgtaggtgcatacg-3 ’
南极犬牙鱼源性成分3 ’端引物：5 ’-ttgctctttgtgtttcggtt-3 ’
南极犬牙鱼源性成分探针：5 ’-fam-tccattaggtaagcgagcgggaaga-bhq1-3 ’
3.1.4 内参照基因真核生物18srrna
内参照5 ’端引物：5 ’-tctgccctatcaactttcgatggta-3 ’
内参照3 ’端引物：5 ’-aatttgcgcgcctgctgccttcctt-3 ’
内参照探针：5 ’-fam-ccgtttctcaggctccctctccggaatcgaac-bhq1-3 ’
3.2 商业化dna提取试剂盒。
3.3 商业化pcr反应预混液。
4 仪器和设备
4.1 实时荧光pcr仪。
4.2 微量紫外分光光度计。
4.3 恒温水浴锅。
4.4 高速冷冻离心机：离心力18,000 g以上。
4.5 微量移液器（0.5 μl- 10 μl，10 μl- 100 μl，20 μl- 200 μl，100 μl- 1000 μl）。
4.6 涡旋振荡器。
4.7 天平：感量0.001 g。
5 分析步骤
5.1 样品前处理
（1）样品只有单块鱼肉组成：使用灭菌剪刀适量剪取中心部位鱼肉。
（2）样品有五块以下鱼肉组成：使用灭菌剪刀适量剪取每个组成部分的中心部位鱼肉。
（3）样品有五块以上鱼肉组成：随机挑选5块鱼肉，使用灭菌剪刀适量剪取每个组成部分的中心部位鱼肉。
将所取得的鱼肉使用灭菌去离子水洗涤，离心去除上清液，尽可能剪碎并混匀。
注：速冻鳕鱼产品应在完全解冻后再取样。
5.2 dna提取
按照商业化dna提取试剂盒说明书中要求的取样量称取样品，每个样品设置两个平行，按照商业化dna提取试剂盒说明书操作。
5.3 dna浓度测定
取1 μl dna溶液，使用微量紫外分光光度计按照dsdna（双链dna）计算方式检测其浓度。
5.4 实时荧光pcr扩增
实时荧光pcr反应体系见表1。
表1 实时荧光pcr反应体系
pcr预混液（2 ×） | 10 μl |
10 μmol/l上游引物 | 0.4 μl |
10 μmol/l下游引物 | 0.4 μl |
10 μmol/l 探针 | 0.2 μl |
dna | 20-50 ng |
灭菌去离子水 | 补充至总体积20 μl |
pcr反应程序：95 ℃ 15 s； 95 ℃ 5 s， 60 ℃ 34 s（读取荧光），40个循环。
5.5 实验对照
分别设置阳性对照、阴性对照、pcr空白对照、空白提取对照各一个。
阳性对照：含相应物种的dna。
阴性对照：不含相应物种的dna。
pcr空白对照：以灭菌去离子水替代dna加入实时荧光pcr反应体系。
空白提取对照：以灭菌去离子水替代样品进行dna提取。
6 结果判断与表述
6.1 质量控制
若以下条件的其中一条不满足要求时，结果视为无效：
阳性对照：荧光通道出现典型的扩增曲线，相应的ct值＜30.0；
阴性对照：ct值≥35.0；
pcr空白对照：ct值≥35.0；
空白提取对照：ct值≥35.0；
内参照反应：荧光通道出现典型的扩增曲线，相应的ct值＜30.0；
样品平行反应：ct值经6.2结果判定后应一致。
6.2 结果判定
（1）如ct值＜30.0，且质量控制符合要求，则判定为检出相应物种源性成分。
（2）如ct值≥30.0，且质量控制符合要求，则判定为未检出相应物种源性成分。
6.3 结果表述
检出 xxx 源性成分。
未检出 xxx 源性成分。
7 防污染措施
检测过程中放置交叉污染的措施按照gb/t 27403中的规定执行。
8 方法检出限
裸盖鱼引物探针检出限范围为0.1 %~5 %，油鱼引物探针检出限范围为1 %~10 %，南极犬牙鱼引物探针检出限范围为1 %~2 %。
注：因使用的设备、试剂盒不同，其检出限有所差异。
责任编辑：小雪